Según la leyenda, la escena que se representa aquí habría tenido lugar tras producirse en Tesalónica en el año 390 un tumulto popular en el que resultó muerto un oficial de Teodosio y ordenar éste que su ejército se lanzara sobre la población, produciendo una matanza de enormes proporciones. Cuando Teodosio regresó a Milán, San Ambrosio, contrario a la matanza, decidió excomulgar al Emperador. Sin embargo estando el santo dando misa en su iglesia tuvo aviso de que Teodosio quería entrar en ella. San Ambrosio salió al encuentro antes de que el Emperador entrase impidiendole el paso y obligandole a pedir perdón a Dios por la ofensa cometida.

Aunque ficticio, el enfrentamiento de San Ambrosio con Teodosio, lleno de posibilidades dramáticas, fue quizá la escena de la vida del santo más representada en la pintura del Renacimiento y del Barroco, debido a la significación que se le atribuía: la afirmación de la superioridad moral de la Iglesia y la reivindicación de su soberanía frente al poder temporal, en cuestiones morales y eclesiasticas.

Aludiendo sin duda de nuevo a la Catedral de Milán, Valdés situó la escena en las escaleras de acceso a una iglesia pseudogótica, y ello, junto a la figuración de soldados en primer término, le permitió crear un cierto efecto de profundidad y situar al santo en el centro mismo de la composición, evitando ese aspecto bipartito que tienen otras pinturas de la serie. La actitud de San Ambrosio, que repele con la mano izquierda al emperador al tiempo que señala con la derecha al Cielo, fuente de su autoridad, está llena de fuerza y energía; la del Emperador, revestido con todos los símbolos de su poder -reluciente armadura, manto púrpura y oro y corona de laurel-, es también sumamente expresiva. Valdés Leal ha sabido transmitir a la perfección la detención en su movimiento de avance y tanto su rostro como sus manos manifiestan la sorpresa que siente. Los soldados del primer término, que se vuelven hacia el espectador en un magnífico movimiento barroco, parecen hacerse eco de la agitación del momento. Y, significativamente, a la izquierda y a contraluz, se yergue una estatua de San Pedro como símbolo de la autoridad de la Iglesia, mientras que el arzobispo y su séquito aparecen cobijados por otras tres figuras, en hornacinas, de las que sólo la central, San Juan Evangelista, es claramente identificable.

Como ya señalara Kinkead (1982), el cuadro está lleno de elementos que parecen trasladar la escena a la Sevilla del XVII: el grupo de clérigos que tras San Ambrosio manifiestan la unidad de todos los estamentos eclesiásticos frente al poder temporal encierra sin duda una galería de retratos de contemporáneos, la torre del fondo recuerda levemente a la Giralda y, con la estructura abovedada que aparece ante ella, evoca la Catedral de Sevilla, y es posible que en el primer plano, la escalinata y el pavimento en espiga encierren una lejana alusión a las gradas de la Catedral.