Hija de Carlos V y de Isabel de Portugal nacida en 1535, Juana se casó con su primo don Juan Manuel, príncipe de Portugal. Tras fallecer este en 1554 y tener un hijo póstumo, don Sebastián, abandonó Portugal y volvió a España, donde murió en 1573. En este retrato aparece de cuerpo entero, apoyando la mano en un sillón vacío, alusivo al trono perdido. Al mostrarla de negro y recortada contra un fondo oscuro, Moro hace que resalte su rostro, de expresión reservada, y la dota de la dignidad y el porte apropiados a los retratos de corte.
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