Rosales representó el momento en que la Reina Católica dicta su testamento en Medina del Campo el 12 de octubre de 1504, días antes de morir. En una estancia regia casi sumida en la penumbra, bajo una cama de dosel, destaca Isabel, con una medalla de la Orden de Santiago colgada del pecho. El blanco de las ropas de cama contrasta con los colores apagados de los presentes. La única nota de color la crea el manto rojo de un apesadumbrado rey Fernando, quien tiene a su lado a su hija Juana. En el grupo de los asistentes se reconoce a Cisneros vestido con el hábito cardenalicio.

La obra fue elaborada por Rosales durante su estancia en Roma. Tras una profunda reflexión sobre cual sería el tema histórico más acertado para ser llevado al lienzo, el pintor elaboró uno de los mejores cuadros de historia de la pintura española. En él se aprecia el recuerdo del realismo atmosférico de las obras de Velázquez, dotando al ambiente de un cierto aspecto vaporoso. La seguridad del dibujo, la calidad de las texturas y lo perfecto de la composición, con una figura de la reina muy iluminada como punto principal de la obra, muestran el grado de compromiso pictórico alcanzado por Rosales en este cuadro.

Adquirido el 22 de febrero de 1865, pasó posteriormente al Museo de Arte Moderno.