Pintura de formato vertical que presenta, sobre un fondo de cielo tormentoso y la ciudad de Toledo, una figura masculina de pie, descalzo, vestida con el hábito común de los menores franciscanos, de color pardo grisáceo, y cordón blanco ceñido a su cintura. En su mano izquierda porta un libro cerrado y mientras que su brazo derecho se flexiona empuñando un báculo en cuyo remate lucen entre rayos el monograma de Cristo. A sus pies aparecen tres mitras.
El encargo del retablo y lienzo de San Bernardino llega a El Greco en el año 1603, en una fecha que podemos situar en la etapa final de la evolución del pintor, quien está reforzando los caracteres simbólicos y abstractos de su obra. Se encuadra, por tanto, dentro del Manierismo.

Así, podemos observar como los caracteres propios de la maniera tienen su traducción en la tendencia a la abstracción por medio del alargamiento de la figura de San Bernardino. Ésta adquiere una verticalidad arbitraria y desproporcionada, próxima al canon de trece cabezas, propio por otro lado, del manierismo italiano de Parmigianino, por ejemplo. La concepción del espacio, la pose del santo y el modelo compositivo complejo manifiestan los alardeos propios del Manierismo. La composición se basa en el agudo triángulo isósceles o el cono que dibuja San Bernardino. La cabeza también es triangular. Igualmente, hay que señalar el recurso a las diagonales, como la que se traza entre el vértice del cayado y el conjunto de mitras, pasando por el libro. Algunos intérpretes ven en esta línea un significado subliminal con gran carga doctrinal que relaciona directamente al obispo o pastor con Jesucristo, en un recorrido que pasa por el magisterio que simboliza el libro.

Por otro lado, como así indica Rafael Alonso, esta última etapa técnica del pintor se caracteriza por una pincelada peculiar y extensa, ligera de material pictórico.

El lienzo de San Bernardino de Siena se encuadra dentro de la temática religiosa de El Greco. En concreto, nos pone en relación con la iconografía hagiográfica, que los posicionamientos tridentinos vinieron a reforzar por el carácter mediador y modélico que los santos van a tener desde el punto de vista de la ortodoxia católica. Así, el retablo de San Bernardino parece estar al servicio de un doble mensaje. Por un lado, transmite un discurso dirigido al conjunto de los fieles, según el cuál éstos pueden salvarse siguiendo el ejemplo de sacrificio y el comportamiento de San Bernardino. Y por otro, parece transmitir, a los alumnos del Colegio del mismo nombre, la idea de la predicación de la palabra. Los alumnos deben seguir el ejemplo de San Bernardino, actuar como predicadores, ser los soldados de Cristo que la Contrarreforma precisaba para la defensa de sus dogmas en contra de los pugnantes movimientos reformistas.

Cuando El Greco proyecta cuadros para retablos utiliza formatos alargados, como ejemplo puedan ser también los lienzos de los retablos laterales de la iglesia de Santo Domingo el Antiguo (Toledo). Además, utiliza soportes de linos venecianos importados, una tela que no es completamente lisa sino que presenta un ligero relieve que resalta y aporta volumen al cuadro. En este caso, se trata de un lienzo de mantel, que no presenta costuras.